triton裂解液_triton裂解液作用_1

triton裂解液_triton裂解液作用

       大家好，今天我想和大家探讨一下“triton裂解液”的应用场景。为了让大家更好地理解这个问题，我将相关资料进行了分类，现在就让我们一起来探讨吧。

1.我的目的蛋白是包涵体还是细菌破碎不完全

2.ripa裂解液能直接做pull down吗

我的目的蛋白是包涵体还是细菌破碎不完全

       细菌工程菌胞内表达主要分为两种形式，一种是在强启动子条件下的高效表达，由于蛋白的过度表达，使蛋白不能及时有效折叠而发生无规则卷曲，以固体颗粒的形式堆积于胞间质中，这就是所说的包涵体，另外一种是间质内的可溶性表达，即可以发生正常折叠，具有生物活性。一般情况下，细菌只要被正常破壁就可以通过离心的形式将包涵体和可溶性表达的蛋白分离开。

       超声破碎的条件一般是300w，10s/10s，20分钟，具体条件可根据自身情况而定。

       超声前菌体的准备：菌液离心后，先用PBS将菌沉淀洗2-3遍，然后按原菌液体积的1/5-1/10加入裂解液重悬菌体，裂解液的成分：50mMTris-HCl, pH8.0, 2mM EDTA，100mM NaCl，加溶菌酶至100ug/ml，0.1%Triton X-100。切记冰浴超声！

       如何判断是否超声完全：一般有以下几个方面：

       1，外观判断：超声前菌悬液是浑浊的，超声完全后变的透明、清澈。

       2，液体的粘滞性：超声后菌液从枪头滴下不粘连。

       3，高速离心：有用高速离心检测超声破碎程度的（一般用6,000 g 10 min, 比一般离心收集菌体的转速高一点）。 沉淀是未破碎或破碎不完全的菌体。

       4，染色：破碎后的菌液涂片，革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟，镜检。

       超声后加入核酸酶消除核酸对蛋白的污染。

       一些需要注意的问题：

       1，蛋白以包涵体形式表达，追求的是高破碎率，要求细胞碎片很小，而另一种蛋白是可溶形式表达，所以细胞碎片不能很小，两种情况要求不同但目的相同，都是便于后期的固液分离。

       2，如果超声时出现黑色沉淀，说明超声功率太强。

       3，超声时间太长、功率太高对蛋白活性肯定有影响。

       4，尽量防止泡沫的产生。

ripa裂解液能直接做pull down吗

       组织RNA抽提失败的两大现象是：RNA降解和组织内杂质的残留。关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞中抽提RNA不容易降解。现有的RNA抽提试剂，都含有快速抑制Rnase的成分。在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解。细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的Rnase，所以RNA得以保持完整。也就是说，培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触，所以其RNA不容易被降解；反过来讲，组织中的RNA之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。因此，假定有一种法，在抑制RNA活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻底解决了。液氮碾磨就是最有效的这样一种法。但是，液氮碾磨方法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。这样就产生了退而求其次的方法：匀浆器。匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制Rnase活性这个问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的Rnase降解RNA的速度快。电动匀浆器效果较好，玻璃匀浆器效果较差，但总的来说，匀浆器方法是不能杜绝降解现象的。因此，如果抽提出现降解，原来用电动匀浆器的，改用液氮碾磨；原来用玻璃匀浆器的，改用电动匀浆器或者直接用液氮碾磨，问题几乎100%能获得解决。影响后续实验的杂质残留问题，其原因比降解样，解决方法相应也不同。总之，如果出现降解现象或者组织内杂质残留现象，则必须对具体实验材料的抽提方法/试剂进行优化。优化大可不必使用您的宝贵样品：可以从市场上购买一些鱼/鸡之类的小动物，取相应部分的材料用于RNA抽提，其它部分用于抽提蛋白质。实验前方法/试剂的选择0：抽提RNA的目的RNA用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同。cDNA文库构建要求RNA完整而无酶反应抑制物残留；Northern对RNA完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR对RNA完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。投入决定产出；每次都以获得最高纯度的RNA为目的，劳民伤财。1：样品的收集/保存–影响降解的因素样品离开活体/或者原来的生长环境后，样品中的内源酶即会开始降解RNA，降解速度与内源酶含量及温度有关。传统上，只有两个法可以彻底抑制内源酶活性：立即加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆；切成小块后立即投入液氮冷冻。这两个法都要求操作快速。后者适合所有的样品，而前者只适合细胞及内源酶含量较低的并且较容易匀浆的组织。具体地讲，植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等最好都先用液氮冷冻起来，再往下做。2：样品的破碎及匀浆–影响降解和得率的因素样品的破碎是为了彻底匀浆，匀浆是为了使RNA彻底完整地释放出来。细胞无须破碎即可直接匀浆，组织需要破碎后才能匀浆，酵母菌和细菌需要先用相应的酶破壁后才能匀浆。内源酶含量较低并且较容易匀浆的组织可以在裂解液中通过匀浆器一次完成破碎和匀浆过程；植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等样品，它们不是内源酶含量高，就是不容易匀浆，所以必须将组织的破碎和匀浆分开操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的匀浆方法是使用电动匀浆器。使用液氮碾磨要特别注意一点：在整个碾磨过程中，样品不得融化，因为冷冻后内源酶更容易起作用。3：裂解液的选择–影响操作方便程度，内源杂质残留的因素常用的裂解液几乎都能抑制Rnase活性，因此，选择裂解液的重点是要结合纯化方法一起考虑。只有一个例外：高内源酶含量的样品建议使用含苯酚的裂解液，以增加灭活内源酶的能力。4：纯化方法的选择–影响内源杂质残留，抽提速度的因素对于干净的样品，如细胞，手边的几乎任何纯化方法都可以获得满意的结果。但对于许多其它样品，尤其是植物，肝脏，细菌等杂质含量很高的样品，选择合适的纯化方法是至关重要的。柱离心式纯化方法抽提速度快，能有效去除影响RNA后续酶反应的杂质，但价格较贵；使用经济而经典的纯化方法，如LiCl沉淀等，也可以获得满意的结果，但操作时间长。

       RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的Western、IP等。

       RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。RIPA裂解液的有很多种，根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。关于不同的RIPA裂解液以及我们生产的其它裂解液的主要特点和差异，以及如何选择裂解液可参考附录。

       RIPA裂解液(强)的主要成分为50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1%TritonX-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，以及2mM sodium pyrophosphate，25mM β-glycerophosphate，1mM EDTA，1mM Na3VO4，0.5 ug/ml leupeptin等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白降解。

       RIPA裂解液(中)的主要成分为50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1% NP-40，0.5% sodium deoxycholate。

       今天关于“triton裂解液”的讨论就到这里了。希望通过今天的讲解，您能对这个主题有更深入的理解。如果您有任何问题或需要进一步的信息，请随时告诉我。我将竭诚为您服务。